BAB I
PENDAHULUAN
I. WAKTU PELAKSANAAN
a. Isolasi DNA : Selasa, 11 November 2008
13.10 – 14.45 WIB
b. PCR (Polymerase Chain Reaction) : Rabu, 12 November 2008
08.15 – 09.30 WIB
c. Agarose Gel Elektrophoresis : Selasa, 18 November 2008
13.15 – 14.45 WIB
II. TUJUAN
1. Menjelaskan struktur dan fungsi materi genetik
2. Mengenali dasar-dasar teknik rekayasa genetika
3. Memahami mekanisme amplifikasi DNA secara enzymatik
4. Memahami mekanisme ekspresi gen
5. Mengenali dasar-dasar teknik Biologi Molekuler
6. Memahami mekanisme visualisasi DNA melalui teknik gel elektrophoresis
III. DASAR TEORI
Dalam melakukan teknik biologi molekuler dapat digunakan sel darah karena yang apling mudah diambil, asalkan tidak memakai sela darah merah untuk mamalia karena tidak berinti. Isolsasi asam nukleat dilakukan karena DNA/RNA merupakan bahan dasar berbagai teknik molekuler biologi. Ekstraksi DNA/RNA dari organisme eukariotik dilakukan melalui proses :
1. penghancuran dinding sel
2. Penghilangan komponen seluler seperti protein, lipid, dan karbohidrat dari sampel
3. Pengendapan DNA/RNA
4. Purifikasi dan Elusi DNA/RNA
Keberadaan guanidin HCl dan Proteinase K sangat diperlukan untuk melisiskan sel dan menonaktifkan Dnase dan Rnase sedangkan urea dan triton X-100 berfungsi untuk mendenaturasi dan melarutkan protein komponen sel (Dono et.al., 2008).
DNA genom yang terlepas dari sel akan terikat pada gel silika dengan keberadaan konsentrasi tinggi garam guanidin HCl. Sedangkan protein dan makromolekul lain akan terkumpul dalam tabung penampung selama sentrifugasi dan pencucian dengan etanol. Pada akhirnya, larutan buffer rendah garam digunakan untuk melepaskan ikatan antara DNA dan matriks silika sehingga terbentuk genomic DNA yang siap digunakan untuk analisis selanjutnya melalui proses PCR (Dono et.al., 2008).
Polymerase Chain Reaction (PCR) adalah suatu teknik untuk menghasilkan berjuta-juta salinan gen atau DNA yang spesifik dalam waktu singkat. Proses ini memerlukan primer spesifik yaitu rantai DNA pendek (kurang lebih 20 bp) yang disintesis berdasarkan DNA target sebagai permulaan penyalinan DNA (Sutarno, 2002; Sianipar, 2003).Proses PCR terdiri dari 3 tahap, yaitu denaturasi dengan suhu tingga (940C-960C), annealing (penempelan primer) dengan suhu lebih rendah dari denaturasi, dan ekstensi (pemanjangan sekuens primer) pada suhu 720C yang dilakukan berulang kali hingga 25-40 siklus (Purwoko, et al, 2002; Sutarno, et al, 2003). Banyaknya jumlah DNA yang dihasilkan memenuhi rumus: 2n , n adalah jumlah siklus PCR. Untuk mendeteksi analisa hasil PCR salah satunya dapat dilakukan agarose gel elektrophoresis.
Agarose Gel elektrophoresis adalah suatu metode untuk memisahkan molekul DNA/RNA berdasarkan berat molekul. DNA dengan berat molekul rendah akan bergerak lebih cepat dari pada DNA dengan berat molekul tinggi. Ada beberapa faktor yang mempengarihi imigrasi DNA yaitu :
1. Ukuran DNA. Semakin kecil ukuran DNA, maka molekul tersebut akan terelektroforesis lebih cepat.
2. Bentuk DNA. Sebaiknya elektrophoresis menggunakan potongan DNA linear.
3. Konsentrasi agarose gel. Peningkatan konsentrasi menyebabkan penurunan kecepatan migrasi DNA dan lebih memungkinkan memisahkan potongan kecil DNA.
4. Voltage. Peningkatan daya saat elektroforesis akan meningkatkan kecepatan migrasi DNA, tetapi akan menimbulkan panas sehingga kadang-kadang gel bisa meleleh.
Loading buffer yang dimasukkan ke dalam sumuran agarose gel berfungsi untuk memberikan berat sampel dan penanda (karena berwarna biru) sampai kapan elektroforesis bisa dihentikan. DNA bermigrasi dari katoda ke anoda. Cara mengetahui berat molekul DNA dengan cara membandingkan dengan marker.
( Paramasari, 2008)
IV. ALAT DAN BAHAN
a. Isolasi DNA
Alat :
1. Tabung Eppendorf / tabung penampung 1,5 mL
2. Tabung high pure purification filter
3. Mikropipet skala 2 – 20 µL dan tip (steril) kuning
4. Mikropipet skala 20 – 200 µL dan tip (steril) kuning
5. Mikropipet skala 100 – 1.000 µL dan tip (steril) biru
6. Vortex
7. Ceentrifuge
8. Thermomixer
9. Refrigerator
10. Photometer
11. Cuvette
Bahan :
1. Elution buffer (10mM Tris-HCl pH 8,5)
2. Sampel darah domba 200 µL
3. Binding buffer (6M guanidine HCl, 10mM urea, 10nM Tris-HCl, Triton X-100 (v/v) pH 4,4)
4. Proteinase K 40 µL
5. Isopropanol 100 µL
6. Inhibitor removal buffer (5M guanidine HCl, 20mM Tris-HCl pH 7,5) 1.000 µL
7. Washing buffer 1.000 µL
8. DDW
b. PCR (Polymerase chain Reaction)
Alat :
1. Ice box
2. Mikropipet skala 0,1 – 10 µL dan tip (steril) putih
3. Mikropipet skala 20 – 200 µL dan tip (steril) kuning
4. Mesin PCR
5. Tabung PCR 0,2 mL
Bahan :
1. 2XPCR Master mix Solution (i-Taq) dari Roche ( sel darah domba)
- i-TaqTM DNA Polymerase 5U/ µL
- dNTPs mixture
- Buffer reaksi
- Gel Loading buffer
2. DNA template (gDNA)
3. Primer (RAPD = Random Amplified Polymerase DNA)
4. DDW (De-ionized Distilled Water)
5. Mineral oil
c. Agarose Gel Elektrophoresis
Alat :
1. Gelas Erlenmeyer
2. Microwafe
3. Bak pembuat gel
4. Sisir
5. Tabung kecil
6. Kabel daya
7. Mikropipet skala 0,1 – 10 µL dan tip (steril) putih
8. Mikropipet skala 20 – 200 µL dan tip (steril) biru
9. Vortex
10. UV Light
Bahan :
1. Produk PCR
2. Genomic DNA
3. 1XTBE Buffer 200 µL
4. 2 gr Agarose
5. SybrSafe (Etidium Bromide) 20 µL
6. Ether 400 µL
7. Loading Buffer
8. Ladder
V. PROSEDUR KERJA
a. Isolasi DNA
1. Siapkan 1 tabung Eppendorf 1,5 mL kemudian masukkan 200 µL sampel darah, 200 µL bindinf buffer (6M guanidine HCl, 10 mM urea, 10 mM Tris-HCl, Triton X-100 (v/v) pH 4,4), dan 4 µL proteinase K.
2. Kocok sebentar.dengan vortex.
3. Tambahkan 32 µL Proteinase K
4. Inkubasi campuran tersebut dengan thermomixer pada sushu 72oC selama 10 menit.
5. Tambahkan 100 µL isopropanol dan vortex kira-kira 30 detik.
6. Masukkan 1 tabung high pure purification filter ke dalam 1 tabung penampung.
7. Pindahkan sample di atas ke dalam tabung pada langkah 6 dengan hati-hati.
8. Masukkan tabung tersebut ke dalam sentrifuge lalu sentrifugasi pada 8.000 x g atau 9.300 rpm selama 1 menit.
9. Selesai sentrifugasi, masukkan 500 µL inhibitor removal buffer (guanidine HCl, 20mM Tris-HCl pH 7,5).
10. Pindahkan tabung high pure purification filter ke dalam penampung baru.
11. Masukkan 500 µL inhibitor removal buffer (guanidine HCl, 20mM Tris-HCl pH 7,5) lalu sentrifugasi selama 1 menit pada 8.000 x g.
12. Tambahkan 500 µL washing buffer dan sentrifugasi pada 8.000 x g.
13. Selesai sentrifugasi, buang cairan dari tabung penampung dan gabungkan kembali dengan tabung high pure purification filter.
14. Tambahkan 500 µL washing buffer lagi dan sentrifugasi pada 8.000 x g selama 1 menit.
15. Estela sentrifigasi, buang cairan dari tabung penampung dan gabungkan kembali dengan tabung high pure purification filter.
16. Sentrifugasi dengna kecepatan 13.000 x g selama 10 detik.
17. Pindahkan tabung high purification filter ke dalam tabung penampung baru dan tambahkan 200 µL elution buffer.
18. Sentrifugasi selama 1 menit pada 8.000 x g dan akhirnya buang tabung high pure purification filter.
19. Ambil 10 µL gDNA dari tabung penampung lalu masukkan ke cuvette.
20. Tambahkan 990 µL DDW ke dalam cuvette.
21. Aduk sampel dengan cara dihisap dan dikeluarkan dengan mikropipet biru (sakala 100 – 1.000 µL) dan jaga agar tidak bergelembung.
22. Masukkan cuvette ke dalam photometer untuk dihitung konsentrasi DNAnya.
23. Sisa sampel disimpan dalam refrigerador pada suhu -20oC untuk PCR.
b. PCR (polymerase Chain Reaction)
1. Masukkan 10 µL 2XPCR Master mix ke dalam tabung PCR
2. Tambahkan 1 µL DNA template dan 1 µL Primer ke dalam tabung PCR.
3. Tambahkan 8 µL DDW ke dalam tabung PCR sehingga total sampel adalah 20 µL.
4. Masukkan 40 µL mineral oil untuk mencegah penguapan sample selama proses PCR.
5. Pippeting seluruh reaksi secara perlahan dengan menggunakan mikropipet 45 µL, jangan sampai terbentuk gelembung udara.
6. Masukkan sampel pada mesin PCR dan lakukan setting amplifikasi dengan kondisi :
· Pre Heat : 95oC → 5’
· Denaturasi : 95oC → 1’
· Annealing : 35oC → 1’ (semuanya 45 siklus)
· Extention : 72oC → 2’
· Extra extensión : 72oC → 10’
Lakukan setting PCR agar setelah selesai amplifikasi secara otomatis akan menyimpan sampel dalam suhu 4oC.
c. Agarose gel elektrophoresis
1. Hilangkan mineral oil yang terdapat di dalam produk PCR dengan menambahkan 200 µL pada tabung PCR.
2. Vortex sebentar.
3. Ulangi langkah 1 dan 2.
4. Setelah selesai akan terdapat fase biru dan putih, buang fase putih dengan pipet 200 µL dan jangan sampai fase biru terambil.
5. Biarkan tabung PCR terbuka agar eter yang tersisa menguap.
6. Siapkan tabung baru, lalu masukkan 10 µL genomic DNA dan 2 V loading buffer.
7. Untuk membuat agar, masukkan 1XTBE buffer sebanyak 200 µL dalam gelas Erlenmeyer dan 2 gr Agarose.
8. Panaskan di microwafe oven pada suhu 90 – 100oC secara berkala goyang-goyangkan gelas, agar campuran mendidih merata dan tidak ada yang terbuang saat mendidih.
9. Setelah mendidih, dinginkan agar pada suhu ruang.
10. Saat suhu mulai dingin, masukkan 20 µL SybrSafe ke dalam campuran, goyang-goyangkan gelas agar merata.
11. Siapkan alat pembuat gel dan letakkan sisir pada tepi bak.
12. Tuangkan campuran agar ke dalam bak pembuat gel sampai sedikit di atas pangkal jari-jari sisir.
13. Biarkan agar menjendal menjadi gel di suhu ruang.
14. Untuk persiapan elektroforesis, tempatkan gel di bak elektroforesis.
15. Tuangkan 0,5XTBE sampai sedikit atas permukaan gel.
16. Sambung-sambungkan kabel sesui kutubnya, set voltase dan durasi waktu.
17. Nyalakan daya untuk melihat bahwa alat bekerja dengan baik (muncul gelembung pada kutub negatif).
18. Setelah alat dipastikan, matikan lagi daya listrik.
(Langkah nomor 7 – 18 berupa demo)
19. Untuk melakukan elektroforesis, masukkan Ladder dan sampel, mulai dari lubang paling kiri untuk marker, kemudian produk PCR, dan yang paling kanan adalah genomic DNA, secara hati-hati jangan sampai melubangi gel.
20. Setelah semua sampel terisikan, tutup bak elektroforesis dengan penutup.
21. Pasang kembali sambungan kabel daya dan set durasi waktu selama 30 menit.
22. Setelah elektroforesis selalesai, ambil gel dari bak elektroforesis lalu tempatkan pada tempat pemotretan.
23. Nyalakan lampu UV dan atur posisi gel lalu ambil gambar dengan kamera digital.
VI. HASIL
Ø Pada saat penghitungan konsentrasi DNA hasil isolasi dengan photometer diperoleh 350,2 µg/mL.
Ø Setelah dilakukan PCR, produk PCR dan genomic DNA dielektroforesis kemudian divisualisasi menghasilkan gambar dibawah ini :
produk PCR genomic DNA
|
|
Dari hasil yang diperoleh saat visualisasi dapat dikatakan bahwa praktikum mengalami kegagalan. Seharusnya pada hasil visualisasi terlihat pita-pita seperti pada Ladder.
VII. ANALISIS
Hasil yang seharusnya diperoleh saat penghitungan konsentrasi DNA adalah berkisar antara 500 – 1.000 µg/mL. Dalam praktikum, hasil yang diperoleh maíz terlalu sedikit. Hal tersebut bisa dikarenakan dalam kesalahan takaran dalam memasukkan bahan. Kemungkinan terlalu sedikit dalam memasukkan sampel darah. Bisa saja dalam memasukkan sampel tersebut, maíz ada sebagian yang tersangkut di mikropipet sehingga takaran menjadi lebih sedikit. Selain itu, bisa disebabkan pada waktu memasukkan genomic DNA di cuvette kurang dari 10 µL, sehangga terlalu encer.
Pada waktu visualisasi didapatkan hasil yang tidak memuaskan, pita DNA tidak terlihat. Seharusnya hasil yang harus diperoleh seperti pada gambar di bawah ini. Gambar tersebut juga menggunakan marker 100 bp DNA Ladder.
|
Pita bisa tidak nampak disebabkan karena beberap hal, diantaranya sudah terjadi denaturasi enzym saat PCR, sehingga DNA tidak bisa diperpanjang. Kemungkinan lain karena adanya RNA yang mengkontaminasi.
Untuk genomic DNA yang tidak nampak sama sekali bisa disebabkan karena rantai yang terlalu panjang, sehingga saat elektroforesis dengan voltase yang kecil, tidak bisa tertarik keluar. Untuk itu perlu diberi enzim restriksi untuk pemotongan gDNA agar menjadi lebih kecil sehingga mudah untuk ditarik keluar. Bisa juga dilakukan dengan cara memisahkan elektroforesis gDNA dengan produk PCR, sehingga elektroforesis bisa dilakukan lebih lama dan tidak mengganggu produk PCR. Hal tersebut dikarenakan durasi waktu yang diperlukan untuk elektroforesis gDNA lebih lama karena usuran yang maíz panjang.
VIII. KESIMPULAN
Isolasi DNA merupakan cara untuk menghasilkan genomic DNA yang diperlukan untuk tahap PCR dan analisis PCR (elektroforesis). Prinsip-prinsip dari isolasi adalah penghancuran dinding sel, penghilangan komponen seluler, pengendapan DNA/RNA, purifikasi dan elusi DNA/RNA. Kontaminan akan mempengaruhi hasil penghitungan konsentrasi DNA menjadi lebih banyak serta menyebabkan pita hasil visualisasi menjadi putih dari atas sampai bawah pita DNA tak terlihat). Sedangkan PCR merupakan suatu teknologi untuk melipatgandakan DNA yang sudah diisolasi agar bisa divisualisasi. PCR tidak memerlukan konsentrasi yang besar. Justru dengan konsentrasi yang kecil akan dihasilkan jumlah yang banyak sehingga bisa divisualisasi melalui proses elektroforesis. Elektroforesis merupakan metode yang digunakan untuk memisahkan molekul DNA / RNA berdasarkan besar molekulnya.
IX. SARAN
1. Saat isolasi sebaiknya dilakukan treatment RNase untuk membuang RNA yang mengkontaminasi.
2. Genomic DNA sebelum dielektroforesis harus dipotong-potong menggunakan enzim restriksi.
3. Elektroforesis untuk genomic DNA dan produk PCR sebaiknya dipisahkan saja sehingga bisa menyesuaikan durasi untuk setiap sampel.
DAFTAR PUSTAKA
Dirgahayu, Paramasari. 2008. Unpublished paper presented at Diskusi Praktikum Biomedik Fakultas Kedokteran UNS.
Indarto, Dono et.al. 2008. Panduan Praktikum Teknik Biologi Molekuler. Surakarta: Fakultas Kedokteran UNS.
Purwoko, A; Sutarno dan N. Etikawati. 2002. Prinsip-prinsip Manipulasi Gen. Edisi 4. Jakarta: UI Press.
Sianipar, N. 2003. Penggunaan Marker RFLP dalam Pemuliaan Tanaman. Bogor. IPB. In: http://www.rudycytcities.com/pps207-71034/nesti_sianipar.html.
Stroncek, John. 2008. Relationship Between Gene Expression and Cell Metabolism in the Marine Bacterium Streptomyces tenjimariensis. http://www.jyi.org/research/re.php?id=142
Sutarno. 2002. Sequence Variation of Bouine Mitodendrial ND-5 Between Haplotypes of Composite and Hereford Breeds of Beef Cottle. Biodiversitas (9), 2 : 213-219.
Tidak ada komentar:
Posting Komentar